Di Federico Fabrizio
Alla luce dell’emergenza epidemiologica da COVID-19, ci soffermeremo in questi giorni a chiarire aspetti rilevanti legati all’area diagnostica e terapeutica nella gestione dei pazienti. Al tal proposito, delucideremo l’iter diagnostico necessario ad identificare l’eventuale presenza dell’agente patogeno SARS-CoV-2 mediante test di laboratorio (prima da tampone nasofaringeo, poi da sangue o siero). Dai risultati che emergeranno dalle analisi potremo limitare non solo la diffusione del contagio ma soprattutto intraprendere le terapie farmacologiche adeguate.
Grazie per il vostro tempo.
E’ opportuno precisare che per un indagine sia di tipo qualitativo che quantitativo relativamente alla carica virale, il test genetico d’elezione è l’amplificazione dell’acido nucleico (RNA), il quale viene convertito in un DNA a doppio filamento ad esso complementare (cDNA) prima di essere amplificato.
L’obiettivo è quello di riprodurre tante copie di acido nucleico mediante una tecnica chiamata real-time RT-PCR (reazione di trascrittasi inversa accoppiata a real-time PCR), a partire da un tampone nasofaringeo.
Le secrezioni delle mucose nasali profonde e faringee vengono prelevate con un bastoncino alla cui estremità si trova un tampone in cotone immerso in un gel che viene rapidamente inviato al laboratorio di ricerca.
L’innesco per avviare il processo di “copiatura” avviene mediante corte sequenze di nucleotidi (primer) complementari alle estremità del segmento di DNA che si vuole amplificare (in tal caso virale) ed attivano l’azione dell’enzima chiamato DNA polimerasi.
Di conseguenza, in presenza del virus, l’enzima inizierà a sintetizzare un nuovo filamento (la fotocopia), sulla base del filamento singolo di DNA ad esso complementare che funge da stampo, con i primer che si appaieranno in maniera specifica alla sequenza (con la formazione di una curva di amplificazione) mentre ciò non succederà in assenza del virus (nessuna curva).
Le copie di acido nucleico saranno sintetizzate ciclo dopo ciclo e all’accumulo delle stesse corrisponderà un segnale di fluorescenza emesso dallo strumento. Dopo un’opportuna conversione del segnale da analogico a digitale, il software elaborerà il dato che verrà validato dall’operatore.
I tempi necessari a realizzare il test sono complessivamente di 3-4 ore, al termine del quale l’operatore dovrà valutare se il virus sarà presente ed in quale concentrazione la carica virale, fornendo una “fotografia” istantanea dell’infezione.
Nella figura sono schematizzate le fasi necessarie all’analisi del tampone nasofaringeo per la diagnosi da Covid-19 [Bibliografia figure: Corman VM et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):2000045. Bibliografia testo: Pfefferle S et al. Evaluation of a quantitative RT-PCR assay for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2 using a high throughput system. Euro Surveill. 2020 Mar;25(9)]. #pillolediricercascientifica
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